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淺談臨床質譜實驗室建設須知
發布時間:2019-06-04 20:53瀏覽次數:

串聯質譜技術應用到臨床醫學以來,便以其高通量、高靈敏度、特異性和準確性高、低檢測限、樣本用量少且前處理簡單、檢測速度快、費用相對低廉等優勢顯示出巨大的生命力,與氣相、液相色譜儀的聯用極大的擴展了質譜技術在臨床檢驗中的分析范圍,使其在國際上迅速應用于生物學及醫藥學等領域。目前串聯質譜技術已經在遺傳代謝性疾病檢測、臨床免疫學檢測、微生物檢測、微量元素/微量營養素檢測、糖化血紅蛋白檢測、激素水平檢測、血藥濃度監測和藥物代謝研究、蛋白質組學和核苷酸多態性研究等多種領域開展應用。

一、臨床串聯質譜儀基本結構

(一)進行質譜分析的儀器稱作質譜儀。通過上述對質譜分離原理的了解,可以知道質譜儀雖然有許多不同的設計,但都是由實現如下基本功能的結構組成: 

1.將樣品分子生成離子(離子源); 

2.按照m/z的大小對離子進行分離(質量分析器); 

3.對選定的離子進行破碎并在下一個質量分析器重再進行分析(串聯質譜具有的功能);       

4.將分離后的離子轉變成電信號并測量其豐度(檢測器);       

5.處理信號、顯示結果、控制儀器(電腦)。 

(二)離子源:

多種離子化技術可被使用在質譜儀中,針對被分析物的性質和考慮到離子化過程中內部能量的傳遞可選擇不同的離子化技術。例如電子電離、化學電離、場電離僅適用于易揮發、熱穩定的化合物;對于熱不穩定及不易揮發的化合物就需要能直接將這些化合物提取到氣態的方法。這種直接的離子源有兩類:液相離子源和固相離子源。在液相離子源中被分析物是處于溶液中,需將溶液霧化并在大氣壓中中形成離子,然后在真空的作用下迫使離子進入分析器,這類離子源有電噴霧(Electro-spray,ESI)、大氣壓中化學電離(Atmospheric pressure chemical ionization,APCI)等。在固相離子源中,被分析物處于不揮發的沉積狀態,這種沉積狀態可由各種制備方法產生,其制備過程經常會涉及引入一種固體或非揮發性液體做為基質,被分析化合物的沉積隨后經高能粒子或光子照射使沉積物表面的離子釋放出來并在電場的作用下進入分析器,這類離子源有基質輔助激光解析(Matrix-assisted laser desorption)、等離子體解析(Plasma desorption)離子源等。 

 

(三)質量分析器:

質量分析器可由不同的原理發展而成。大致而言它們可以分為兩類,一類是以時間的尺度將不同質荷比的離子進行分離,例如四級桿質譜;另一類則是以空間的尺度將不同質荷比的離子進行分離,例如離子阱質譜。當然分類也可以用質量分析器的其他性質,比如脈沖式的或是連續式的等等。隨著儀器的發展,也出現許多將不同的質量分析器聯用的組合,例如四級桿-飛行時間(Quadrupole-TOF)等。當評價一臺質譜儀的性能,一般會考慮到以下這些因素:可分析的質量區間、分析速度、傳送能力(進入分析器與到達檢測器離子的比例)、質量準確度和分辨度。表一列出了某些常用質量分析器的基本特征。

 

質量分析器的某些基本特征

 

Quardruple

(四極桿)

Ion Trap

(離子阱)

TOF

(飛行時間)

Magnetic

(磁)

質量限制(Th)

4000

6000

>>1000000

20000

分辨率(FWHM,m/z1000)

2000

4000

20000

100000

準確度(ppm)

100

100

200

10

兩個或數個質量分析器可被串聯起來使用,使得在前級質量分析器中的選定碎片在后一級質譜中得到進一步分析,這樣的質譜被稱為串聯質譜(MS/MS或MSn)。也可以將色譜(氣相或液相)連接在離子源的前端做為樣品的輸入裝置,使得色譜的分離能力與質譜的分離鑒定能力得到疊加,被稱為色質聯用(GC-MS或LC-MS),聯用的質譜部分自然也可以是串聯質譜。目前臨床實驗室中最常用的質譜就是液相色譜與串聯質譜聯用(LC-MS/MS)。

(四)檢測器和電腦:

檢測器的作用在于使通過質量分析器的離子產生電信號(電流),此電流的強度與其豐度成比例。對離子的測定無非總是根據其電荷、質量或是速率。由于在每個特定時間點上由質量分析器中出來的離子有限,其所形成的電流也十分有限,因此其后部都連有放大電路。檢測器與質譜的其他部件一樣仍處于不斷發展之中以應對新的需求,例如測定質量很大的離子。

      電腦在質譜分析中的基本作用與許多分析儀器基本相同,主要有三個功能:控制儀器、獲取和加工分析資料集對數據進行解讀,從而最后向用戶輸出一份分析結果的報告。這其中涉及到模數信號的轉換、分析過程中的取樣頻率與分析質量的關系,用戶也應該對所用數據庫的特點有所了解,以便對電腦給出的分析結果有正確的解讀。

二、臨床串聯質譜儀工作原理

液相色譜-串聯質譜法定量是將含有穩定同位素內標的沉淀劑溶液對血漿樣本進行蛋白沉淀,然后取上清液進行稀釋,最后用液相色譜-串聯質譜系統進行檢測,采集質譜信號。通過建立已知濃度分析物(標準品)與目標分析物響應值之間的函數關系,實現對樣本的定量檢測。

三、獲國家藥品監督管理局認證的臨床質譜儀器

(一)國產醫療器械匯總表

1.四極桿質譜:

2.微生物或核酸質譜(飛行時間質譜)、呼氣質譜:

 

(二)進口醫療器械匯總表

1.四極桿質譜:

2.微生物或核酸質譜(飛行時間質譜):

四、臨床串聯質譜儀安裝注意事項

實驗室硬件包括水電氣、噪音、廢物、空間,IT和輔助設施。由于質譜用在臨床是近幾年的事,已有的實驗室很可能不能滿足質譜的需要。要能保證對儀器和員工提供一個安全、舒適的環境。所以,在做規劃時,還要考慮到將來的發展以及和實驗室其它部門的互動和合作。

1.用電:質譜對電的要求較高。電壓要跟儀器匹配(有110伏的,有220伏的),電流要達到要求,電壓要穩(可選穩壓器)。最好把儀器(包括質譜、色譜、電腦)都接在不間斷電源上。插座也要和儀器的插頭匹配,插座的數目(16A插座≥3個,10A插座≥6個)要滿足工作需求,且距離不能太遠。UPS輸出電壓值零線與地線要求小于2V,UPS功率宜根據儀器使用功率及考慮以后的發展。另外前期場地改建可以讓儀器供應商技術人員現場勘測并給出改建意見。

2.用氣:質譜里常用的氣有氮氣、氦氣和氬氣。其中氮氣用量最大。儀器少的時候可以用氮氣發生器,儀器數目多的時候(超過五十臺)最好用中央供氣系統。注意氣體純度和壓力的要求。氬氣用量不大,鋼瓶就可以了。一些特殊的儀器可能會有特殊的氣體要求。比如負離子檢測可能需要用zero gas。

3.試劑:色譜純級(導電率18.2)以上水(或屈臣氏純凈水);化學品試劑甲醇和乙腈宜購買進口默克或菲舍爾(質譜級)。

4.噪音:質譜需要很高的真空。抽真空的泵往往會產生噪音,尤其當儀器多的時候。氮氣發生器也有噪音。最好能做到人機分離。如果做不到人機分離,最好能把真空泵和氮氣發生器放在其他房間。如果這個也做不到,可以在墻上貼一層能吸收噪音的泡沫,或者把泵藏在箱子里,但需要注意的是,真空泵會產生熱,所以注意不要讓箱內溫度太高。

臨床質譜實驗室平面圖(參考)

5.廢氣:質譜儀工作中產生廢氣,需要排到室外。實驗室改造或建造時要預留通道。

6.廢液:色譜儀會產生廢液,需要有處理廢液的裝置和流程,并把無害的廢液和有害的廢液分開。建方法時也可以試一試對環境不是那么有害的試劑,比如用乙醇代替甲醇,用乙酸代替甲酸。

7.空間:儀器到貨需要有貨梯和能夠進入的實驗室門寬的要求,實驗臺的寬度(≥90cm)和承重(≥500KG)要求。儀器周圍要留有足夠的維修空間(離墻≥50cm)。還要預留空間(離心機、通風廚、冰箱等)和桌面給樣品的制備和擺放(打印機,垃圾桶,廢液缸,試劑瓶等)。儀器位置和擺放要合理,盡量減少操作人員來回走路的步數。如把色譜儀放在質譜儀上面。但需要注意漏水和限高。

常規檢測項目所需購買的輔助設備清單

8.環境:質譜儀對實驗室溫度、濕度、震動和光線有較高的環境控制要求才能讓保證儀器的正常運轉。實驗室設計的既要保證儀器的要求,也要滿意員工舒適的工作環境要求。

 

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