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淺談動植物細胞培養室建設
發布時間:2019-06-24 20:16瀏覽次數:


細胞培養技術與其他一般實驗室工作的主要區別在于要求保持無菌操作,避免微生物及其他有害因素的影響。目前,超凈工作臺的廣泛使用,很大程度上方便了組織細胞培養工作,并使一些常規實驗室有可能用于進行細胞培養。 

 

 

 

     細胞培養實驗室應能進行六方面的工作:無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲藏。 

    因此,無論是動物細胞培養室還是植物細胞培養實驗室,必定有一下幾種房間。 

 

①洗滌間:根據工作量的大小決定其大小。在實驗室的一側設置專用的洗滌水槽,用來清洗玻璃器皿。中央實驗臺還應配置水槽,用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大,可以購置一臺洗瓶機。準備洗液缸,專門用于洗滌對潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應耐濕并排水良好。 

 

②培養基配制間:配備的主要儀器設備有:冰箱、天平、微波爐、pH計、培養基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規格的培養瓶、培養皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲藏瓶等。 

 

③消毒間:配備實驗臺、高壓滅菌鍋、排風滅火設備、細菌過濾設備、干熱消毒柜、電爐等。 滅菌鍋的選擇應根據不同的要求選擇不同型號的滅菌鍋。一般實驗室可選用小型的醫用手提式高壓滅菌鍋,較大的實驗室可選用立式自動控制壓力和溫度的滅菌鍋。生產性的實驗室可選用大型的臥式滅菌鍋。如果沒有條件的話,可以將上述工作間合并成一個準備間,要求是設備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風,地面要便于清潔、防滑。 

 

④無菌操作室:無菌操作室主要用于實驗材料的接種操作,所以又叫接種室。通常由里外兩間組成,外間是緩沖間,用于準備工作,還有防止污染的作用。緩沖間的門應該與接種室的門錯開,兩個門也不要同時開啟,以保證無菌室不因開門和人的進出帶進雜菌。緩沖間內應該設有水槽、實驗臺、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操作室的內壁應當用塑鋼板或瓷磚裝修,工作人員進入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。室內應配有超凈工作臺,紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。 

 

⑤培養室。

 

 

 

在實驗室內,還會有以下常用的基本設備。

 

 
 

儀器

 
 

 

(1)顯微鏡:倒置顯微鏡——是組織細胞培養室所必需的日常工作常規使用設備之一,便于掌握細胞的生長情況并觀察有無污染等。 

 

(2)培養箱:體外培養的細胞和體內細胞一樣,需要在恒定的溫度下生存,大多數情況下,最適溫度是37℃,溫差變化一般不應超過±0.5℃,細胞在溫度升高2℃時,持續數小時即不能耐受,40℃以上將很快死亡。因此需要有能控制溫度的培養箱,如具有較高靈敏度的恒溫培養箱及CO2培養箱。 

 

(3)干燥箱:用于細胞培養箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用,玻璃器皿等須干熱消毒。干熱消毒時,電熱干燥箱升溫較高,一般需達到160℃以上。通常使用鼓風式電熱干燥箱。其優點是溫度均勻、效果較好,缺點是升溫過程較慢。升溫時不能先升溫后鼓風而應鼓風與升溫同時開始,至100℃時,停止鼓風,應避免包裹器皿的紙或棉花燒焦,燒焦的碎屑可影響細胞的生長。消毒后,不能立即打開箱門以免驟冷而導致玻璃器皿損壞,應等候溫度自然下降至100℃以下方可開門。 

 

(4)水純化裝置:細胞培養對水的質量要求較高,細胞培養以及與細胞培養工作相關的液體的配制用水必須事先嚴格純化處理。水純化時可采用離子交換裝置或蒸餾器。離子交換純水尚不能有效去除有機物,因此用水時尚需再次蒸餾。進行細胞培養時配制各種培養液及試劑等均需使用三次蒸餾水:即使是用于玻璃器皿的沖洗,也應使用二次以上蒸餾水。 

 

(5)冰箱:細胞培養室必須配備。

a.普通冰箱或冷藏柜 

——儲存培養液、生理鹽水、Hank’s液試劑等培養用的物品及短期保存組織標本。 

b.低溫冰箱(-20℃)、超低溫冰箱 

——用于儲存需要冷凍保存生物活性及較長時期存放的制劑,如酶、血清等。 

——細胞培養室的冰箱應屬專用,不得存放易揮發、易燃燒等對細胞有害的物質,且應保持清潔。 

 

(6)細胞冷凍儲存器:儲存器常用的是液氮容器。根據使用需要分為不同的類型及多種規格。選擇購置液氮容器時要綜合考慮容積大小,取放使用方便及液氮揮發量(經濟)三種因素。液氮容器的大小可自25L~500L,可以儲存1ml的安瓿250~15000個左右。液氮溫度可低達-196℃,使用時應防止凍傷。由于液氮不斷揮發,應注意觀察存留液氮情況,及時定期補充液氮,避免揮發過多而致細胞受損。 

 

(7)離心機:進行細胞培養時,常規需要進行制備細胞懸液、調整細胞密度、洗滌、收集細胞等工作,通常需要使用離心機。 

a.一般可常規配置4000rpm的國產臺式離心機,例如細胞沉降,使用80~100g的離心機即可,離心力過大有時可能引起細胞的損傷。 

b.另外,可根據需要添置其他類型如大容量或可調節溫度的離心機等。 

c.若需特殊用途,例如某些細胞的分離制備需梯度離心,則需另行配置實驗所需的具備其他特殊功能的離心機。 

 

(8)天平:常用的有扭力天平、精密天平及各種電子天平。 

分析天平的感量為0.1mg、0.01mg和0.001mg。根據稱取物質的量和稱量精度的要求,選擇適宜級別的天平。要求精密稱定時,當取樣量大于100mg選用感量為0.1mg天平,在100-10mg選用感量為0.01mg天平,小于10mg選用感量為0.001mg天平。 

 

(9)消毒器:直接或間接與細胞接觸的物品均需消毒滅菌處理。 

 

(10)濾器:目前細胞培養工作中采用的培養用液,包括人工合成培養液、血清、消化用胰酶等常含有維生素、蛋白、多肽、生長因子等物質,這些物質在高溫或射線照射下易發生變性或失去功能,因而上述液體多采用濾過消毒以除去細菌。 

 

 

 
 

培養用器皿

 
 

(1)培養器皿:供細胞接種、生長等用的器皿,可由透明度好、無毒的中性硬質玻璃或無毒而透明光滑的特制塑料制成。 

(a)玻璃培養器皿的優點是多數細胞均可生長,易于清洗、消毒,可反復使用,并且透明而便于觀察;缺點是易碎,清洗時費人力。 

(b)塑料制培養器皿的優點是一次性使用,廠家已消毒滅菌密封包裝,打開即可用于細胞培養操作。 

 

常用的培養器皿: 

培養瓶:由玻璃或塑料制成。主要用于培養、繁殖細胞。進行培養時培養瓶瓶口加蓋螺旋瓶蓋或膠塞,膠塞多用于密封培養。國產培養瓶的規格以容量(ml)表示,如250ml、100ml、25ml等;進口培養瓶則多以底面積(cm2)表示。 

培養皿:由玻璃或塑料制成,供盛取、分離、處理組織或做細胞毒性、集落形成、單細胞分離、同位素摻入、細胞繁殖等實驗使用。常用的培養皿規格有10cm、9cm、6cm、3.5cm等。 

多孔培養板:為塑料制品。可供細胞克隆及細胞毒性等各種檢測實驗使用。其優點是節約樣本及試劑,可同時測試大量樣本,易于進行無菌操作。培養板分為各種規格,常用的規格有:96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。 

各種單層生長的細胞在培養器皿中長滿時可獲得的細胞數,主要是取決于器皿的底表面積和細胞體積的大小。常用培養器皿及可獲得的細胞數(以Hela細胞為例)。 

 

(2)培養操作有關的器皿: 

a.貯液瓶:主要用于存放或配制各種培養用液體如培養液、血清及試劑等。貯液瓶分為各種不同規格,如1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、5ml等。 

b.吸管:主要分為刻度吸管、無刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、轉移液體,常用的有1ml、2ml、5ml、10ml等規格。無刻度吸管分為直頭吸管及彎頭吸管,除可以作吸取、轉移液體外,彎頭尖吸管還常用于吹打、混勻及傳代細胞。 

c.加樣器(移液器):用于吸取、移動液體或滴加樣本。可根據需要調節量的大小,吸量準確、方便。尤以微量加樣器,可保證實驗樣品(或試劑)含量精確,重復性良好。目前,可高溫消毒的,多通道的各類移液器可供使用者選擇,能確保加樣準確、快速、方便并且達到無菌要求。 

 

(3)其他用品:尚有收集細胞用的離心管,放置試劑或臨時插置吸管用的試管,裝放吸管以便消毒的玻璃或不銹鋼容器,用于存放小件培養物品便于高壓消毒的鋁制飯盒或貯槽,套于吸管頂部的橡膠吸頭,封閉各種瓶、管的膠塞、蓋子、凍存細胞用的安瓿或凍存管、不同規格的注射器、燒杯和量筒以及漏斗,超凈工作臺使用的酒精燈,供實驗人員操作前清潔消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型噴壺等。 

 

 
 

器械

 
 

主要用于解剖、取材、剪切組織及操作時持取物件。 

 

(1)常用的有:手術刀或解剖刀、手術剪或解剖剪(彎剪及直剪),用于解剖動物、分離及切剪組織,制備原代培養的材料;眼科虹膜小剪(彎剪或直剪),用于將組織材料剪成小塊;血管鉗及組織鑷、眼科鑷(彎、直),用于持取無菌物品(如小蓋玻片)夾持組織等;口腔科探針或代用品,用以放置原代培養之組織小塊。 

 

(2)特殊設備:細胞培養實驗室除了應配備上述的常用基本設備以外,如有條件,可添置一些特殊或先進的設備儀器,以便更有效、更精確、更深入地進行實驗室工作。 

例如:  

①酶聯免疫檢測儀——可用于進行免疫學測定及細胞毒性、藥物敏感性檢測等。 ②超低溫冰箱(-85℃)——便于儲存某些試劑及標本。 

③旋轉培養器——用于某些特殊細胞或需要收獲大量細胞的培養。 ④熒光顯微鏡——進行熒光染色樣本的觀察。 ⑤流式細胞儀——可更精確及快速檢測細胞。 ⑥用于檢測細胞培養條件的各種儀器,例如專門為快速分析細胞培養基中主要或關鍵營養成分、代謝產物及氣體含量設計的多功能細胞培養分析儀、手提式CO2濃度測定儀等。 

 

 

 
 

植物細胞培養實驗室

 
 

 

     除了上面那些基本的設備以外,對于植物細胞培養實驗室來說,為了控制培養室的溫度和光照時間及其強度,培養室的房間不要窗戶,但應當留一個通氣窗,并安上排氣扇。室內溫度由空調控制,光照由日光燈控制。天花板和內墻最好用塑料鋼板裝修,地面用水磨石或瓷磚鋪設,一般要分兩間,一為光照培養室,一為暗培養室。培養室外應有一預備間或走廊。  

     而且,培養室應配有培養架、轉床、搖床、光照培養箱、生化培養箱、自動控時器等。日光燈一般用40W,固定在培養架的側面或擱板的下面,每層有兩支日光燈,距離在20cm,光照強度為2000-3000lx。 

     當然,植物培養需要輔助實驗室,因此還需要鑒定室和溫室。 鑒定室包括細胞學鑒定室和生化分析室。 

     細胞學鑒定室是為了對培養材料進行細胞學鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥,使各種光學儀器不受潮濕和灰塵污染。應配置各種顯微鏡、照相系統等。 

     在以培養細胞產物為主要目的的實驗室中,應建立相應的分析化驗實驗室,以便于對培養物的有效成分隨時進行取樣檢查。儀器包括離心機、酶聯免疫檢測儀、天平、PCR儀等。 

     溫室是用于試管苗的鍛煉和移植,為試管苗提供滿足生長的適宜環境條件。  

常用設備有:溫室、彌霧裝置、蔭棚、移栽床、缽、盆、基質等。 

 

 

 
 

動物細胞培養室

 
 

 

     對于動物細胞培養室來說,要保持無菌條件,因此要設置凈化工作室,風淋室,傳遞窗,高效過濾器,潔凈層流罩,生物安全柜,超凈工作臺,其中還要包括紫外燈,電熱干燥箱,濾器,高壓滅菌器。為了避免培養時出現細菌,會適當在培養液中添加抗生素,因此在培養室內要有抗生素。 

     為了滿足動物細胞生長所需的條件,在培養室里也要設置純水蒸餾器,純水儀,培養板,培養瓶, CO2培養箱,培養基,血清。培養基是要根據培養的組織或細胞的類型不同而配制不同的培養基,配制時一定要加血清,而血清可以選用小牛血清。 

     檢測細胞的儀器設備有倒置顯微鏡,酶標儀 ,微孔板震蕩器,高速離心機,移液器,保存細胞的儀器設備是液氮罐。 

     細胞培養實驗室還要包括實驗室、準備間、緩沖間、培養室。 其中,實驗室的要求有以下幾點: 

①和緩沖間相連,緩沖間內備消毒服裝和鞋,口罩等,入內換上; 

②設置1—2臺超凈工作臺; 

③室內空氣不流通,有適當的光線,清潔,干燥; 

④側部可設傳遞窗,用于物品傳遞; 

⑤照明用熒光燈為好,消毒用紫外線燈; 

⑥在室內工作時,動作應輕微。 

    對于準備間,里面要求有大、小水槽,消毒設備,消毒后的物品和器械保藏柜,烘箱,蒸餾器(包括雙蒸,三重蒸餾水),玻璃器皿,培養液,電爐等。 

 

所以,我們可以理解為緩沖間就是上面最基本實驗室設備中的消毒間,準備間就是消毒間和培養基配制間,而實驗室就是無菌操作室。 

 

 

 
 

社會價值

 
 

 

     細胞培養實驗室的社會價值在于,為實驗提供基礎,促進細胞培養的發展,細胞培養的好處如下: 

1.直接觀察活細胞的形態結構和生命活動。用于細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫學和腫瘤學等多種學科研究。 

2.直接觀察細胞的變化可便于攝影。 

3.研究細胞種類如低等到高等到人類、胚胎到成體、正常組織到腫瘤。 

4.便于使用各種技術:相差、熒光、電鏡、組化、同位素標記等方法觀察和研究細胞狀況。 

5.是分子生物學和基因工程學的研究對象,也是其主要的組成部分。 

6.易于施用物理、化學生物的實驗研究。 

7.易于提供大量生物性狀相似的實驗對象,耗資少比較經濟。  

8.成為生物制品單克隆抗體生產和基因工程等的材料來源。 

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